Criopreservación de semen de zángano de Apis mellifera como herramienta para aumentar la variabilidad genética y evitar la reducción de la población

Alexandra Medrano

Alexandra Medrano

Ayrton Bautista

Ayrton Bautista

David Choque

David Choque

Renzo Chávez

Renzo Chávez

Revista Científica SCIENTIA, Vol 2. Agosto 2020

scientiaunalm@gmail.com

Lima, Perú

Disponible Online en www.journalscientia.com/larevista

Artículo de revisión

Criopreservación de semen de zángano de Apis mellifera como herramienta para aumentar la variabilidad genética y evitar la reducción de la población

David Choque1, Renzo Chávez1, Ayrton Bautista1, Alexandra Medrano1

1Círculo de Investigación en Biotecnologías Reproductivas (BIOREP), Universidad Nacional Agraria La Molina.

Resumen:

 Las abejas de la miel (Apis mellifera), junto a las otras especies de abejas, son los polinizadores más importantes, permitiendo la propagación de muchos de los cultivos que el hombre aprovecha. Las condiciones ambientales y las prácticas humanas actuales han propiciado la disminución de las poblaciones de estas especies, situación que tendrá terribles consecuencias ambientales en el futuro. Es por ello que surge la necesidad de buscar alternativas que permitan aumentar dichas poblaciones. Así, la criopreservación de semen de zángano resalta como una biotecnología reproductiva muy útil. Los zánganos cumplen un rol indispensable en la reproducción y crecimiento de una colmena, por lo que conservar su semen a largo plazo mediante la criopreservación es de vital importancia. Múltiples investigaciones demuestran la eficiencia de este método para aumentar las poblaciones de abejas. Sin embargo, la condición de frío es el principal inconveniente de esta técnica, por lo que la optimización del método y la aplicación de los crioprotectores adecuados son indispensables.

Palabras clave: Abeja de la miel, Apis mellifera, zángano, criopreservación de semen, crioprotectores, variabilidad genética, población de abejas, sostenibilidad.

Abstract: Honey bees (Apis mellifera), as well as other bee species, are the most important pollinators, allowing the propagation of many of the crops man uses. The current environmental conditions and human activities have generated a decline in the population of these species, a situation which will have dire environmental consequences in the near future. For that reason, it is necessary to check new alternatives to increase those populations. Thus, Drone semen cryopreservation emerges as a valuable reproductive biotechnology to conserve the species. Drones play an essential role in the reproduction and growing of the beehive, so conserving their semen for extended periods through cryopreservation is vitally important. Various researches have demonstrated its efficiency in increasing bee populations. Nevertheless, cold conditions are the main difficulty of this technique, so its optimization and application of correct cryoextenders are indispensable.

Keywords: Honeybee, Apis mellifera, drone, semen cryopreservation, cryoextender, genetic variability, honeybee population, sustainability.

Introducción

De todas las especies polinizadoras que existen, las abejas, sobre todo las abejas de la miel (Apis mellifera), son las más importantes debido a su gran tamaño y que están cubiertas de pelo (características cruciales para transportar polen); a demás que dependen completamente de las flores y que son muy abundantes [1]. Esta función polinizadora, en conjunto con otras especies, logra asegurar el 35% de la producción mundial de cultivos, aumentando la producción de 87 de los principales cultivos alimenticios del mundo, y de muchos cultivos medicinales [2]. Adicionalmente, las abejas producen otros alimentos muy importantes, tales como la miel y el polen [2], y son uno de los elementos bases para el mantenimiento de ecosistemas [1].

Sin embargo, la población mundial de abejas, y otros polinizadores, se está reduciendo en muchas partes del mundo [2]. José Graziano da Silva, Director General de la FAO, comentó que “las abejas están bajo la gran amenaza del cambio climático, la agricultura intensiva, el uso de pesticidas, la pérdida de biodiversidad y la contaminación” [2]. Por ello, la FAO prevé que si se mantiene dicha disminución poblacional los cultivos nutritivos como frutas, nueces y verduras

serán sustituidas por cultivos básicos como el arroz, el maíz y la papa, provocando una dieta desequilibrada [2].

Entre sus propuestas, la FAO recomienda el uso de técnicas reproductivas para controlar poblaciones de abejas [3]. Así, una técnica muy prometedora es el uso de semen criopreservado de zángano [4]. Esta técnica mejora la variabilidad genética de las abejas y, en consecuencia, puede mejorar su resistencia frente a algunas enfermedades [4]. Sin embargo, se han reportado algunos efectos negativos de criopreservar semen debido al cambio de temperatura, el shock térmico y formación de cristales [4]. Dichos efectos pueden ir desde disminuir la motilidad hasta disminuir la habilidad fecundante del espermatozoide [4]. Por ello, revisaremos aspectos básicos sobre la reproducción en abejas, características del semen, cómo se realiza la criopreservación y el uso de crioprotectores, los cuales reducen la incidencia de efectos negativos.

1. Reproducción en las abejas 

Las abejas tienen una forma peculiar de reproducción, la cual se lleva a cabo en zonas denominadas áreas de congregación de zánganos (ACZ) donde son visitadas por reinas de otras colonias

[5] Estas áreas son abiertas y están protegidas por una cubierta vegetal para evitar los fuertes vientos [5]. Es muy común encontrarlas cerca de un apiario [5].

La reina busca aparearse con la mayor cantidad de zánganos [6]. En un estudio realizado por Schlüns y Cols en [6] se encontró que, de 21 abejas reinas que salieron a realizar sus vuelos nupciales, el 14% no regresó a su colonia porque al parecer ellas no habían conseguido aparearse con la suficiente cantidad de zánganos en un solo vuelo, lo que las llevó a hacerlo de nuevo [6].

Kraus y cols [6], encontraron que el número de apareamientos se encuentra en promedio entre 10 y 28 con un valor medio de 17.32 [6]. Estos datos quedan lejos de las demás bibliografías consultadas en las cuales afirman ser entre 8 y 45 apareamientos [6]. Sin embargo, no cabe duda que las Abejas reinas tienen una especie de umbral que incluye un cierto número de cópulas, que una vez que lo consigue vuelve a la colonia [6].

1.1 Colección de semen del zángano

Mackensen y Ruttner  y también Cobey et al. [7]. Plantearon un método dividido por fases, la primera fase de este método consiste en apretar el tórax del zángano o rodarlo ligeramente, manteniendo su abdomen hacia arriba, esta presión hará que se contraigan los músculos abdominales seguida de la eversión parcial del endófalo [7]. Una segunda fase del mismo método consiste en la eversión completa del endófalo mediante una presión gradual aplicada a los lados del abdomen, comenzando desde el

segmento anterior hasta el final del abdomen [7].

1.2 Abeja reina.

Valega [8], menciona que el inicio del ciclo biológico de la abeja reina inicia con la postura de un huevo que tarda entre 3 a 5 días en nacer. Luego empieza la etapa larval que dura 5 días [8]. Luego del segundo día de nacida, la reina comienza a salir en vuelos cortos de reconocimiento y entre el séptimo y décimo día sale a fecundarse en más de un vuelo con 10 a 16 zánganos [8]. Al final comienza con la postura que aproximadamente al día 14 ya debe observarse [8].

La función de la reina es únicamente poner huevos que aseguren la continuidad y supervivencia de la sociedad [9]. En la espermateca retendrá las células germinativas, ese es el motivo por el cual el abdomen es muy desarrollado [10]. Una de las funciones de la reina aparte de generar descendencia también es impedir la formación de otras reinas y atrofiar la capacidad sexual de las obreras mediante la secreción de una feromona que se extiende por toda la colmena [10].

2. Diversidad genética

Uno de los principales motivos para investigar en la conservación de semen de zángano es la preservación de la diversidad genética de las abejas. La diversidad genética proviene, hasta cierto punto, de las diferencias en las secuencias de ADN (conocidas como polimorfismos) entre los individuos de una misma especie [11]. Ésta contribuye a la habilidad de una especie para adaptarse a cambios en su entorno, y es uno de los

principales factores en la conservación de especies en peligro de extinción [11,12].

En el caso de la abeja melífera, así como en el de muchos otros insectos, su característica de poliandria (apareamiento de una reina con múltiples machos) permite que la diversidad genética de la colonia sea mayor a la que se obtendría mediante apareamiento monógamo [13].

Se han conducido experimentos para comprobar las ventajas de una mayor diversidad genética en la colonia[13–15]. En un ambiente controlado para simular el de una colonia natural, las colonias con mayor diversidad genética demostraron tener mayor resistencia ante enfermedades, además de producir 30% más panales (estructuras hexagonales de cera donde las abejas almacenan la miel y el polen), y 27 a 78% mayor productividad por parte de las obreras, quienes retornaban a la colmena llevando miel con mayor rapidez que en colmenas genéticamente uniformes [13]. La mayor producción estimada puede ser resultado de una mejor comunicación entre las obreras, demostrado por un aumento en la frecuencia de obreras realizando la danza de la abeja, sistema de comunicación usado por esta especie. Se detectó en promedio 36% más danzas y 62% más vueltas por danza en comparación a una colonia con menor diversidad genética [14]. Incluso en colonias comerciales, cuyas variables ambientales son mucho menos controladas que las de un experimento, la diversidad genética tiene efectos positivos en la supervivencia de las abejas, pues contribuye a que los individuos de la colonia sobrevivan a más enfermedades, aumentando su longevidad [15].

Así como es posible aumentar la diversidad genética en una colmena

mediante el apareamiento de la reina con una mayor cantidad de zánganos [13], la diversidad genética también se puede ver reducida por otros factores, reduciendo la supervivencia de la población de abejas. Los insecticidas neonicotinoides son de uso muy extendido, de los más usados a nivel mundial por ser efectivos contra plagas de insectos. Sin embargo, causan efectos sub-letales en las abejas. Actúan a nivel del sistema nervioso, y se demostró que las reinas expuestas a estas sustancias tienen problemas reproductivos, almacenando menores niveles de semen en su espermateca y reduciendo el número de zánganos con los que se aparean, resultando finalmente en menor diversidad genética en la colonia [16].

3. Características seminales

El semen está compuesto por los espermatozoides y el líquido de la vesícula seminal, en la proporción de 2:1, lo cual le da las características de intensidad de color y viscosidad [17]. Puede mezclarse con cualquier medio acuoso aparte de tener un pH de 6.8 a 7 [18].

3.1 Volumen

Gençer [19] y Rousseau [20], colectaron un volumen de eyaculado por zángano de 1.01 ± 0.03 μL y 1.01 ± 0.016 μL respectivamente, los cuales fueron influenciados por el efecto combinado de la edad de los zánganos y la fecha de reproducción. Otro estudio de Rhodes [21] obtuvo un promedio de 1.09 μL de semen de zángano. Teniendo en cuenta los efectos de la estación y la edad, en ese caso el volumen del semen fue mayor en primavera que en otoño o verano.

3.2 Motilidad

La calidad espermática de los espermatozoides se mide por diversos factores, uno de ellos es la motilidad el cual cumple un papel trascendental al momento de la fertilización [21]. El análisis espermático es considerado un instrumento importante para la evaluación potencial de fertilidad de los machos, se determinó que el estudio de la motilidad del esperma, la cual es la evaluación de velocidad del esperma y el porcentaje de espermatozoides móviles, cumplen una relación positiva  al éxito de la fertilización en varias especies [22].

Cuadro 1. Recopilación de estudios en la viabilidad espermática

Tipo de semen y dilutor

Porcentajes

Semen fresco y diluido

Combinaciones de SYBR-14 con yoduro de propidio [20]

64.2 ± 1.07%

Combinaciones de SYBR-14 con yoduro de propidio [24, 26]

60% a 80%

Semen fresco sin diluir

Solución diferente mezclada con el yoduro de propidio [27]

90.7%

Semen posdescongelado

Utilizando Dimetilsulfóxido (DMSO) como crioprotector [24]

49.32 ± 2.28%

Glicerol como crioprotector [24]

45.47 ± 1.69%

Glicerol como crioprotector [24]

51.8 ± 3.6%,

Usando DMSO [25]

69.5 ± 3.2%

Fuente: Elaboración propia

 

A pesar de los resultados positivos, Harbo [28] indica que la inseminación con semen congelado en las abejas reinas produce ejemplares no demasiados fuertes, lo cual dificulta la dirección de la colmena para la producción de miel; al contrario genera una alza para la producción de progenie de reinas.

La motilidad es un parámetro que se ve afectado muy fácilmente a las condiciones ambientales, la evaluación se realiza en semen fresco y diluido, razón por la cual es imprescindible proteger el semen [23].

3.3 Viabilidad espermática

El fundamento de la utilización del crioprotector es mantener viabilidad espermática después de descongelarlo [24, 25]. Diferentes expertos realizaron la evaluación de la viabilidad utilizando diversos métodos, para una mejor interpretación de los resultados observamos el Cuadro 1.

Varios científicos obtuvieron diferentes valores de concentración espermática de zánganos en el resultados en sus estudios, para simplificar estos datos se realizó una comparación de los más relevantes (Cuadro 2).

3. 4. Concentración

Cuadro 2. Comparación de estudios enfocados a la concentración espermática.

 

Autor

Año

Concentración espermática

(x 106/mL)

Rhodes [21]

2008

3.63 (por zángano)

Taylor  [24]

2009

8.80 ± 0.98

(por eyaculado)

Gençer [19]

2011

7.32 ± 0.11

(por eyaculado)

Rousseau [20]

2015

1.80 ± 1.65

(por eyaculado)

Metz & Tarpy [29]

2019

4.93 ± 0.15

(por eyaculado)

Fuente: Elaboración propia.

La cantidad de espermatozoides dentro de de las vesículas seminales tiene una relación directa con el tamaño del zángano maduro, se comparó los huevos de zánganos en celdas de obreras (zánganos pequeños) y en celdas de zánganos (zánganos normales); y se obtuvo un promedio de 7.45 ± 0.461 x 106/mL y 11.95 ± 1.007 x 106/mL, respectivamente [30].

4. Criopreservación

La criopreservación del semen es una técnica reproductiva que tiene como finalidad conservar la viabilidad y preservar sus funciones básicas de las células, debido a que atraviesan por el proceso de congelamiento, exposición a temperaturas bajo cero, y el post descongelamiento [31]. Los estudios iniciales, entre 1970 y 1980, en criopreservación de semen de abejas melíferas fueron intentos improductivos

debido a que gran parte de las abejas reinas inseminadas colocaron huevos no fecundados [32]. En las abejas melíferas es importante la criopreservación principalmente por la pérdida de genes, disminución del germoplasma, a causa de una creciente tasa de mortalidad en distintas partes del mundo [33] que con lleva a una disminución de la población generalmente afectada por los ácaros varroa, a esta circunstancia se llama trastorno de colapso de colonias [26]. La criopreservación en los insectos tiene un uso limitado, la abeja pertenece a ese pequeño grupo capaz de reproducirse por inseminación artificial [34].

4.1 Dilutores

Se realizó pruebas con distintos dilutores de semen para optimizar la criopreservación en nitrógeno líquido, gracias al estudio de Harbo [28] se determinó que la mezcla  más eficiente de almacenamiento es 60% de semen, 10% de DMSO (dimetilsulfóxido) y 30% de solución salina. Unos años después Harbo [35] realizó una prueba de semen criopreservado en distintos tiempos de almacenado, los resultados que se obtuvieron fueron de 22% de crías obreras en 4 días de almacenamiento a comparación de una muestra congelada de semen durante dos años produció solo 8% de crías obreras.

La diferencia entre las tasas de fertilización posterior a la criopreservación en abejas melíferas no tiene una razón clara; cuando se utilizó DMSO la tasa de fertilidad fue baja y se presume que el DMSO tuvo un efecto negativo en el ADN del semen congelado causando un daño [36]. 

Con el objetivo de impedir la toxicidad del agente crioprotector, el cual cumple un papel importante en los procesos de refrigeración, congelación y descongelación en el estrés físico que sufren los espermatozoides [37]. Los crioprotectores más utilizados en los mamíferos y zánganos son DMSO, etilenglicol, glicerol y 1,2 propanodiol [38], de los cuales podemos observar dos crioprotectores en el  Cuadro 3.

Cuadro 3. Características biofísicas de los crioprotectores DMSO y glicerina [23].

Parámetros

DMSO

Glicerina

Fórmula química

(CH2)2SO

C3H5(OH)3

Peso molecular

78.13

92.10

Peso especifico (g/cm3 a 20 °C)

1.10

1.25

Concentración (g/L)

1.0 M

78.13

92.10

3.0 M

234.39

276.30

Concentración (ml/L)

1.0 M

71.00

73.70

3.0 M

213.10

221.10

Los estudios enfocados en crioprotectores a través de los años, han delimitado información valiosa, se evaluó el DMSO como crioprotector y se determinó que presentaba una alta viabilidad post descongelamiento a comparación de la glicerina, también una mayor cantidad de obreras [28, 24, 26].

En el uso de glicerina, se determinó que afecta a la célula de forma negativa con un alto porcentaje de muerte celular previa congelación, siendo esta una razón ha considerar su eliminación como crioprotector [26]. Para seguir trabajando con el DMSO se evaluaron otros trabajos, donde la mezcla de otros crioprotectores reduce toxicidad de este, volviéndose un crioprotector viable, debido a que los espermatozoides solo sobreviven al congelamiento con la presencia de DMSO [39].

5. Métodos para criopreservación

Existen pocos métodos para criopreservar los espermatozoides de abejas (Apis mellifera). Un banco de espermatozoides conservados nos podría permitir la creación de una reserva de semillas para la restauración de la diversidad genética a través de la inseminación artificial [40]. Un primer trabajo de Stucky [40] lo hizo utilizando diferentes tipos de diluyentes del tipo DMSO [40] y también ver el efecto de la supervivencia de los espermatozoides después de la descongelación. Los resultados arrojaron que usando el diluyente DMSO que contenía: DMSO al 40%, yema de huevo al 25%, tampón al 50 % y 60 % de semen y luego usando una criocámara para congelar los espermatozoides que estaban a  -40°C. [40]. Los tratamiento utilizados en este trabajo reaccionaron bien a este diluyente, con 93.18% de efectividad y lo demás fueron 78.84% , 38.9% y por último 26% [40].

Un segundo trabajo de Kaftanoglu [41] preservó semen de zángano durante 359 días con nitrógeno líquido a -196 °C, probó 11 diluyentes, mezcló 10% de semen con 60% de diluyente de Kiev que contenía sulfóxido de dimetilo al 10%, luego se congeló a 3-4 °C por cada minuto y el resultado fue el esperado, inseminaron a 15 reinas y sobrevivieron 13, de las cuales produjeron un área de cría de 345 ± 60 cm2 en donde el 53.72% eran de la progenie obrera de los espermatozoides congelados [41].

Una mirada hacia el futuro

Actualmente, son muchos los proyectos enfocados a restablecer las poblaciones de abejas en todo el mundo. Criopreservar semen de zángano es una alternativa desde el punto de vista reproductivo con resultados prometedores. No solo ayudaría a aumentar las poblaciones de abejas, sino que también mejorará la variabilidad genética y, en consecuencia, se tendrá animales más resistentes. Sin embargo, no es un método que se esté utilizando a gran escala por su complicación técnica y el tiempo que tarda. Futuras investigaciones permitirían agilizar el proceso con el fín de realizarlo a gran escala y lograr solucionar la disminución actual de las poblaciones de abejas, y

evitar las terribles consecuencias, mediante el uso de la criopreservación de semen de zánganos.

Agradecimientos

Los autores agradecemos al Ing. Zootecnista Joaquín Amen por su contribución en este trabajo.

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  1. bUENO, aYRTON, ME GUSTARÍA CCONVERSAR CONTIGO PARA SABER UN POCO MAS DE ESTE ARTÍCULO DE CONGELACIÓN DE SEMEN DE ZÁNGANOS. SALUDOS