Técnicas moleculares aplicadas a la caracterización de agentes fitopatógenos- Una revisión

Diego Morales

Diego Morales

Elizabeth Ramírez

Elizabeth Ramírez

Olenka Alberca

Olenka Alberca

Ivan Teves

Ivan Teves

Revista Científica SCIENTIA, Vol 1. Julio 2020

scientiaunalm@gmail.com

Lima, Perú

Disponible Online en www.journalscientia.com/larevista

Artículo de revisión

Técnicas moleculares aplicadas a la caracterización de agentes fitopatógenos- Una revisión

Elizabeth Ramírez1, Diego Morales1, Ivan Teves1, Olenka Alberca1

1Círculo Estudiantil Molinero de Fitopatología (CEMF), Universidad Nacional Agraria La Molina

Resumen: La tecnología molecular se ha convertido en una de las herramientas más importantes en el desarrollo de la medicina y laboratorio clínico. También tiene aplicaciones en el estudio y desarrollo de nuevas técnicas de manejo fitosanitario en la agricultura, debido a que se centra en las bases de nuevas tecnologías para la prevención y manejo de enfermedades en plantas. Al conocerse los principios bioquímicos tales como la afinidad de moléculas y complementariedad de bases de los ácidos nucleicos(ADN y ARN), se pueden utilizar determinadas técnicas que constituyan herramientas eficaces para la caracterización de determinados agentes fitopatógenos. Así encontraremos en los biosensores, pirosecuenciación, hibridación de ácidos nucleicos, RPC y sus variantes, RFLP, NGS y microarreglos  posibles alternativas para el secuenciamiento o localización de genes en genomas completos. Conforme a la finalidad, se podrán brindar alternativas confiables de diagnóstico y control de las enfermedades en plantas.

Palabras Clave: Caracterización, biosensores, RCP, pirosecuenciación, hibridación, RFLP, microarreglos de ADN

Introducción

A lo largo de la historia, los agentes fitopatógenos han generado muchos problemas en los campos agrícolas que,  sumado a la falta de instrucción y preparación de los agricultores, la incipiente  información y escasas investigaciones, dieron paso a crisis fitosanitarias de importancia económica y alimentaria.  Debido a esto, la agricultura se vio obligada a desarrollarse en el campo de la tecnología molecular con el fin de estudiar, investigar y generar conocimiento para la evaluación, detección y manejo de organismos fitopatógenos que ocasionan pérdidas considerables en la agricultura.

Los organismos fitopatógenos cada vez más sobrepasan las barreras geográficas locales y fronterizas de cada país. Generalmente estos agentes están identificados, monitoreados y controlados en su lugar de origen, pero al introducirse en un ecosistema ajeno y de parámetros favorables o indiscriminados para su desarrollo, se pueden llegar a convertir en agentes muy agresivos llegando incluso a escalas epidemiológicas. La tecnología molecular es una herramienta de gran importancia en lo que respecta a la caracterización de agentes fitopatógenos, convirtiéndose así en el recurso más importante para enfrentar la problemática actual, que amenaza la agricultura y la economía de la región, como el agente fitopatógeno Fusarium oxysporum raza 4 tropical que perjudica enormemente los cultivos de banano en Latinoamérica.

A continuación se presentan algunas técnicas moleculares que pueden ser utilizadas para la detección de fitopatógenos, así como una alternativa de prevención y monitoreo de los mismos.

Biosensores

Un biosensor es un dispositivo analítico que usa reacciones bioquímicas específicas y consta de dos partes, una sensible o biosensor y un transductor físico químico.  Al interactuar el primero con un analito ocasionarán cambios físicos o químicos que serán detectados y transformados a una señal eléctrica por el transductor [1].

Según Correa et al. [1] los biosensores se pueden clasificar según su estructura y su forma de acoplamiento del elemento de reconocimiento y el transductor. Para ello, el transductor y la fase sensible deben poseer afinidad, selectividad y la capacidad de permanecer estable por un tiempo determinado.

Las aplicaciones más comunes son en los análisis clínicos para medir la glucosa en personas con diabetes y para la detección de anticuerpos anti-VIH, también se aplica para la detección e identificación de microorganismos patógenos y toxinas producidos por estos, para el control de calidad de alimentos, detección de agentes químicos  biológicos contaminantes [1].

Pirosecuenciación

La pirosecuencia consiste en la detección luminométrica de pirofosfato que se libera como resultado de la incorporación de nucleótidos del ADN en un templado amplificado por la acción del ADN polimerasa y que es liberado, una vez que se incorpora un nucleótido, con señales de luz proporcionales al número de nucleótidos incorporados [2]. Sus principales aplicaciones son la detección de mutaciones/polimorfismos y la identificación de marcadores genéticos en estudio de casos de control. Como técnica molecular presenta ciertas ventajas en

exactitud, flexibilidad, automatización y rapidez cuando se compara con el método de Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) [2]. Por todo lo mencionado, se puede automatizar de forma masiva y en paralelo cientos de miles de secuencias que pueden llegar hacer hasta 100 Mb en una sola carrera donde no se requiere de electroforesis u otro fragmento de separación [3].

Hibridación de ácidos nucleicos para la localización, cuantificación y expresión de genes

Angarita et al. [4] definen a la hibridación de ADN como el análisis de muestras para detectar la presencia de ácidos nucleicos (ADN o ARN), realizando una combinación anti paralela de estos con una molécula de doble cadena. Esta técnica se usa en el diagnóstico de enfermedades, la identificación de agentes patógenos, estudio de perfiles de expresión genética, localización e identificación de genes en ADN o ARNm, en la comparación filogenética de especies patógenas y en la epidemiología.

Muchas técnicas moleculares están basadas en la hibridación, de modo que se han desarrollado variantes para distintos estudios y aplicaciones. 

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) es una técnica basada en la hibridación de ADN, esta consiste en la amplificación o síntesis de una región comprendida en el ADN, extraído de un organismo de interés, por medio de una secuencia de nucleótidos

complementarios, o primers, que lo delimitan. En comparación con las pruebas serológicas, biomoleculares, entre otras; ofrece una mayor sensibilidad para la identificación de patógenos fitosanitarios y  a diferencia de los métodos convencionales como la identificación morfológica, existe la posibilidad de realizar secuenciamientos completos del fragmento amplificado para un estudio más completo del patógeno. 

RCP simple o de punto final

La RCP simple o de punto final consiste en la amplificación de una región de ADN para identificar organismos a un nivel más específico que los métodos microbiológicos convencionales como la caracterización morfológica. El análisis de su aplicación se concreta luego de realizar un proceso llamado electroforesis que permite observar y describir, de manera cualitativa, el amplicón sintetizado (Región de ADN amplificado), a través de una cámara especial que emite luz ultravioleta. De esta manera, se puede estimar el peso o tamaño de la región amplificada de ADN (en pares de bases nitrogenadas) utilizando un marcador de peso molecular como referencia.

RCP múltiple

La RCP múltiple es una variante de la RCP, en la que múltiples loci se amplifican para una misma reacción siguiendo los criterios de inclusión o exclusión de las secuencias diana que es una selección que puede hacerse en base a órganos, sistemas, sintomatología o características epidemiológicas [5]. Para adaptar el protocolo de RCP múltiple (RCPm) se deben estudiar las características clínicas, epidemiológicas y las características biológicas de los patógenos [6].

Esta técnica tiene varias aplicaciones, tales como la identificación de algunas especies de agentes patógenos, análisis simultáneo de marcadores múltiples incluyendo las deleciones, mutaciones, polimorfismo, empleada en análisis microsatelital, detección de organismos modificados, detección de patógenos y tipificación de diferentes cepas [5].

Según los criterios de Gryta [6] las alteraciones en las concentraciones de MgCl2, dNTPs y enzima usualmente influyen poco en la mejoría de sensibilidad o especificidad de la prueba múltiple, por ello se necesita un enfoque gradual en la combinación de juegos de primers. Asimismo, se necesita de controles internos que deberán incluir muestras de control negativo y un control positivo que a su vez servirán de señalización en casos de bandeos dudosos [7]. Para prevenir la contaminación, facilitar la amplificación y detectar las amplificaciones internas se usa dUTP-uracil-N-glicosidasa (actúa eliminando residuos de uracilo de la cadena de ADN al reemplazar dUTP por dTTP), AmpliTaqGold polimerasa (activada solo a altas temperaturas) y ligasas LDR (detectan posibles mutaciones) [6].

Polimorfismo de Longitud de Fragmento de Restricción

El Polimorfismo de Longitud de Fragmento de Restricción (también conocido como RFLP por sus siglas en inglés) es una técnica que permite detectar fragmentos de ADN con dos tipos de variantes, Multiplex PCR-Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (M-T-RFLP) y Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) para hacer una detección de bacterias, archaea y hongos, a su vez permite describir los cambios en la estructura y diversidad de la

comunidad microbiana [6]. Esta técnica es muy usada para la clasificación e identificación de especies de hongos [8] y bacterias, ya que solo se necesita el aislamiento del patógeno, que contenga grandes cantidades de ADN [6]. Se requiere de una preparación de mezclas de reacción para una amplificación inicial seguida de la preparación de la mezcla de las endonucleasas de restricción y corrimiento en gel de agarosa [2].

RCP con Transcriptasa inversa

La técnica de RT-RCP (RCP con transcriptasa inversa), de acuerdo con Agarita et al. [4], también se basa en la hibridación de ADN pero para aplicaciones distintas. Este método se utiliza para la síntesis de cadenas de ácidos nucleicos a partir de ARN o ARNm mediante una transcriptasa inversa que sintetiza un tipo de ADN llamado cADN (ADN complementario). En la actualidad, se utiliza la RT-RCP para la preparación de materiales a utilizar en técnicas moleculares mucho más avanzadas como RCP en tiempo real, la NGS y los microarreglos de ADN.

RCP en tiempo real

La TR- RCP (RCP en tiempo real) es otra técnica de hibridación de ADN que según Tamay de Dios [9], consiste en una RCP simple o múltiple donde se utilizan moléculas fluorescentes para el estudio y monitoreo de fragmentos amplificados de ADN. Actualmente, este método es utilizado por ser el más sensible para detectar, cualitativa y cuantitativamente, los ácidos nucleicos y medir la expresión del ADN sin ningún paso posterior; a diferencia de la RCP simple, que solo permite el análisis cualitativo de los ácidos nucleicos. Una de las aplicaciones más utilizadas es la de cuantificar ligeras variaciones en la expresión genética

mediante la detección de ARNm procedentes de células o tejidos.

Secuencias paralelas, masiva o de Nueva Generación (NSG)

Este es otro método basado en la hibridación, “permite establecer el orden de los nucleótidos a evaluar en las moléculas de ADN o ARN” [4], razón por la cual ha aumentado su uso en los últimos años, principalmente en las investigaciones de laboratorios clínicos.

Angarita et al. [4], sostienen que este método permite realizar una secuenciación masiva y paralela de millones de fragmentos de ADN y/o ARN presentes en la muestra, por lo que tiene una alta aplicación en estudios epidemiológicos debido a que permite el uso de genomas completos para el establecimiento de árboles filogenéticos entre especies, determinación de posibles recombinaciones y marcadores epidemiológicos que aportan a la identificación de posibles mutaciones en una población. En ese aspecto, se considera como una  tecnología revolucionaria en estudios epidemiológicos, diagnósticos clínicos, ciencia forense, agronomía entre otras.

Microarreglos de ADN

Los microarreglos son considerados uno de los métodos más importantes para el estudio y recopilación de información obtenida a partir de la secuenciación de genomas completos.

Al igual que el PCR y NGS, este método se basa en la hibridación de ácidos nucleicos y permiten hacer análisis comparativos de cómo se  expresan cientos de genes en una sola prueba. Por ello, actualmente, son los mejores para el análisis de

expresión de genes en comparación con la TR-RCP, debido a la mayor cantidad de secuencias que se puede analizar por prueba [10].

Los microarreglos de ADN tienen sus aplicaciones en los perfiles de expresión genética, estudios de patogenicidad, farmacogenómica y diagnóstico de enfermedades. No solo permite la identificación de los microorganismos y la expresión de sus genes sino también el estudio de mutaciones y genotipos de resistencia mediante experimentos comparativos. En ese sentido, se pueden detectar factores de virulencia de microorganismos de interés clínico; así como el análisis de la célula hospedadora, a nivel genético, en respuesta a las acciones de estos.

Conclusiones

Las técnicas moleculares son una alternativa altamente confiable para la caracterización de agentes fitopatógenos. Cada método presentado se caracteriza por su alta sensibilidad, especificidad y flexibilidad que facilitan el estudio de un genoma completo o secuencias específicas de ADN. A partir de estos, se puede detectar y analizar secuencias de interés para investigación en las ciencias agronómicas. Cabe señalar que se debe conocer el principio de cada técnica, de modo que se ajusten a la finalidad que se desea investigar para dar soluciones oportunas para el control de los patógenos.

Referencias

1. Correa A, Parra H, Hoyos K. Diagnóstico molecular y biosensores. Colombia: Universidad de Córdoba; 2015. [Consultado 12 Jul 2020]. Disponible en: https://www.academia.edu/19329537/Diagnostico_molecular_y_biosensores

2. Llanes-Alvarez Y, Hernández-Rodríguez L, Peña-Bárzaga I. La validación de métodos de diagnóstico como herramienta en los programas de vigilancia y manejo de fitopatógenos. CitriFrut  [Internet]. 2017 [Consultado 12 Jul 2020]; 34(1): 46-54.

3. Bondkly A. Chapter 28 – Sequence Analysis of Industrially Important Genes from Trichoderma. En: Gupta V, Schmoll M, Herrera-Estrella A, Upadhyay RS, Druzhinina I, Tuohy M, editores. Biotechnology and Biology of Trichoderma. 1ra ed. Poland: Elsevier; 2014. p. 377-392.

4. Angarita Merchán M, Torres Caicedo MI, Díaz Torres AK. Técnicas de Biología Molecular en el desarrollo de la investigación. Revisión de la literatura. Rev haban cienc méd [Internet]. 2017. [Consultado 12 Jul 2020]; 16(5): 796-807. Disponible en: http://www.revhabanera.sld.cu/index.php/rhab/article/view/1651

5. Bolivar AM, Rojas A, Garcia-Lugo P. PCR y PCR-Múltiple: parámetros críticos y protocolo de estandarización (PCR and PCR-Multiplex: critical parameters and standardization protocol). Avan Biomed [Internet]. 2014. [Consultado 12 Jul 2020]; 3(1): 25-33. Disponible en: https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=4796903

6. Gryta A, Frac M. Methodological Aspects of Multiplex Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism-Technique to Describe the Genetic Diversity of Soil Bacteria, Archaea and Fungi. Sensors. 2020; 20: 1-18.

7. Zachar V, Thomas R, Goustin AS. Absolute quantification of target DNA: a simple competitive PCR for efficient analysis of multiple samples. Nucleic Acid Res. 1993; 21(8): 2017-2018.

8. Kawabata H, Dancel L, Villanueva S, Yanagihara Y, Koizumi N, Watanabe H. flaB-Polymerase Chain Reaction (flaB-PCR) and Its Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Analysis Are an Efficient Tool for Detection and Identification of Leptospira Spp. Microbiol Immunol. 2001; 45(6): 491-496.

9. Tamay de Dios L, Ibarra C, Velasquillo C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigación en discapacidad. 2013; 2(2): 70-78.

10. Reyna-Murrieta ME, Valenzuela-Sánchez JF. Microarreglos de ADN: Aplicaciones en la microbiología. Epistemus. 2019; 13(26):42-47.

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